Valentino Rossi suit son père Graziano Rossi, et commence à courir en compétition en 1996 pour Aprilia dans la catégorie 125 cm³, il obtient cette année-là sa première victoire au grand-prix de République Tchèque à Brno. Il devient champion du monde de la catégorie l'année suivante.

Il rejoint ensuite la catégorie 250 cm³, encore avec Aprilia, où il termine deuxième du championnat du monde 1998, seulement 3 points derrière Loris Capirossi, puis triomphe en 1999.

En 2000, Valentino signe un contrat avec l'usine Honda et passe dans la catégorie reine des 500 cm³. Il termine le championnat du monde à la deuxième place derrière Kenny Roberts Jr. C'est pendant cette année que Valentino découvre son chef mécanicien actuel, le célèbre Jeremy Burgess (ancien chef mécanicien de Mick Doohan). Puis, il gagne le championnat du monde 2001 avec une Honda NSR deux temps. En 2002 et 2003, il est encore titré dans la nouvelle classe MotoGP, tout juste créée, en chevauchant la Honda quatre temps RC211V, moto qui est encore considérée comme la "référence" en termes de machine dans la catégorie.

En 2004, il rejoint l'écurie Yamaha et conserve son titre après sa 8e victoire d'une saison marquée par sa rivalité de plus en plus intense avec Sete Gibernau. En 2005, il survole le championnat en remportant 11 victoires.

Le public apprécie son palmarès à présent semblable à celui d'icônes telles que Mike Hailwood et Giacomo Agostini, ainsi que son apparent mépris du danger et les sketchs qu'il présente avec ses copains d'enfance de Tavullia, petit village situé près de Pesaro.

Valentino Rossi est le pilote de course le plus doué de sa génération et un des plus doués de l'histoire de la moto de vitesse. Il semble apprécier plus que tout la bagarre en course, surtout contre son grand rival italien Max Biaggi ou contre Sete Gibernau, comme à Jerez au Grand Prix d'Espagne 2005 où il s'imposa au prix d'un dépassement musclé et audacieux.

Valentino Rossi, en plus d'être un pilote d'exception et un homme très estimé par le public, est si proche de son équipe technique qu'elle le suivit, fait extrêmement rare, lorsqu'il quitta Honda pour rejoindre Yamaha.

Durant sa carrière de pilote, il se sera affublé de plusieurs surnoms, dont Rossifumi en hommage au pilote japonais Norifumi Abe qu'il admire, puis Valentinik, en référence au héros de bandes-dessinées Paperinik. Son surnom le plus connu restera The Doctor.

Le championnat 2006 marque un tournant dans sa carrière, Valentino n'écrase plus la concurrence comme les saisons précédentes. Le champion italien subit 2 casses moteur (rarissime) et est mis en difficulté d'abord par Loris Capirossi puis par l'américain Nicky Hayden. Lors du dernier GP à Valence, Rossi chute au 5ème tour et le titre va à Nicky Hayden pour cinq points, clôturant ainsi un règne de 5 ans.

En 2007, l'ex-champion est dominé pendant toute la saison par Casey Stoner qui s'octroie 10 Grands Prix (sur 18) quand Valentino doit se contenter de seulement 4 victoires. Il termine la saison 2007 à 126 points du nouveau champion du monde et fini seulement 3ème du championnat, un point derrière Dani Pedrosa. C'est son plus mauvais classement en championnat du monde depuis 1996. Pire, il est dominé par les deux plus grands espoirs de la catégorie.

En plus des difficultés rencontrées au niveau sportif, Rossi est rattrapé par le fisc italien qui lui réclame environ 60 millions d'euros au prétexte que sa domiciliation londonienne serait fictive.

En 2008, Jorge Lorenzo, issu de la catégorie 250cm³ qu'il vient de remporter les deux années précédentes, remplace Colin Edwards comme coéquipier de Valentino Rossi. Ce dernier étant équipé pour la première fois de pneumatiques Bridgestone alors que Lorenzo roule en Michelin, les deux coéquipiers font box séparés afin de prévenir tout risque d'espionnage industriel.

Fin janvier il déclare lors de la présentation de la moto engagée en 2008, qu'il souhaite vraiment finir sa carrière chez Yamaha.

Le 31 août 2008, après deux succès consécutifs à Laguna Seca et Brno, Rossi remporte le grand prix de Saint-Marin et entre ainsi dans la légende en égalant le record de 68 victoires en catégorie reine de Giacomo Agostini.

Le 14 septembre 2008, pour le premier Grand Prix MotoGP organisé sur le circuit mythique d'Indianapolis aux USA, il décroche sa 69e victoire et devient seul recordman des victoires en catégorie reine. Sa victoire à Motegi (la 5e consécutive cette saison) lui assure le titre à 3 courses de la fin de saison.

Bien que 8 fois champion du monde, il a toujours préféré porter le numéro 46, son numéro fétiche. Le fameux numéro 1, destiné au champion du monde, apparaîtra cependant sur sa moto à 2 reprises : en 1999 en 250 cm³ alors qu'il pilotait la moto du champion du monde en titre, et en 2002 sur le carénage de sa Honda (cette année-là, il avait superposé le numéro 1 et le numéro 46). Le numéro 1 trouve tout de même sa place sur l'épaule droite de sa combinaison, visible des autres pilotes mais seulement quand "le docteur" est devant.

Il a un moment été question que Valentino Rossi devienne pilote de Formule 1, il a d'ailleurs fait plusieurs essais en Formule 1 chez Ferrari en 2004 et 2005. Il s'est également essayé au rallye automobile :

abandon lors du rallye de Grande-Bretagne en 2002.
11ème du rallye de Nouvelle-Zélande en 2006.
12ème au rallye de Grande-Bretagne en 2008